学生自W到高C的25种方法(学生自残的方法)

很多朋友对于学生自W到高C的25种方法和学生自残的方法不太懂，今天就由小编来为大家分享，希望可以帮助到大家，下面一起来看看吧！

阅读文章前辛苦您点下“关注”，方便讨论和分享，为了回馈您的支持，我将每日更新优质内容。

CRP作为血浆急性期蛋白，临床上一直以来通过对其浓度的测量作为炎症指标?因此，在此基础上，我们准备建立一套能够对CRP进行定量的方法?

基于Potempa报到的研究手段，即使用1/20SDS-PAGE对pCRP与mCRP在凝胶上进行区分?如果能够对其浓度做到绝对定量，按照循证医学的随机样本实验，比较患者不同病理状态的浓度值。根据检测结果，将会成为揭开CRP生理功能的关键，同时也具有临床指导作用。

实验材料-实验仪器

Millipore纯水仪，伯乐(Bio-Rad)电泳仪，垂直电泳槽，蛋白转印槽。3立超速离心机，细胞超净台，水平摇床，摆动摇床，电子天平，恒温水浴锅，酶标仪，pH计，生化恒温培养箱。

主要试剂

甘氨酸、Tris、SDS(十二烷基硫酸钠)、丙烯酰胺、双甲叉、DTT(二硫苏糖醇)、NEM(N-乙基马来酰亚胺)、Tween-20(吐温-20)、BCA试剂盒。

蛋白相关试剂

胎牛血清(无菌)；人血清来源商品化C-反应蛋白(纯度大于99%)，存储在TBS-Ca缓冲液(10mMTris，140mMNaCl，2mMCaCl2，pH7.4)。

五聚体CRP的稳定依赖于钙的存在；mCRP(通过脲变性五聚体CRP，经过透析除去脲而制得)；mCRP特异性单克隆抗体(mAb)3H12(鼠源)；二抗为HRP标记抗体(sigma)。

透析袋的前处理

透析袋是一种半透膜。分子在半透膜间的分离是由膜两侧不同溶液浓度差驱动的，半透膜对于分子的截留取决于半透膜的微孔尺寸。实验室常用的半透膜一般认为对于蛋白的截留是100%，即蛋白是不能通透的。

蛋白质透析的原理就是利用蛋白质分子不能通过半透膜，从而使蛋白质和一些小分子物质分离(如，无机盐、单糖等)。

因为透析袋在出厂时都经过甘油的处理，而且还会含有极微量物质，这会对蛋白质造成影响，鉴于此，我们买的商品化透析袋在使用前需要预处理，具体步骤如下：

将透析袋用纱布包裹后，放入含有50%的乙醇烧杯里，煮沸lh(此步操作要注意明火，防止乙醇燃烧)；

煮沸后，使用50%的乙醇冲洗透析袋的内外表面。

然后用NaHCO3(10mM)+EDTA(ImM)煮沸5minX2次(每次都更换溶液)，煮沸后依次使用蒸馏水，去离子水冲洗；

将冲洗干净的透析袋置于去离子水的烧杯中高压灭菌，冷却后4°C保存。

mCRP的制备

根据LawrenceA.Potempa报到的研究方法体外制备mCRP，将天然五聚体CRP(pCRP)通过螯合Ca2+离子并用高浓度的脲处理，即得到单体形式的C反应蛋白(mCRP)。

具体操作如下：

1)透析液配置：lOmMTris，15mMNaCl，0.02%NaN3，室温pH调至7.4。使用透析液配置10MUrea，pH7.4和50mMEDTA，pH7.4；

2)根据mCRP使用量及保存时间决定制备量：(200ul10MUrea+25ul50mMEDTA+25ulCRP)XN(根据CRP初始浓度决定N数值)；37°C摇床孵育2h；

3)使用1)的透析液，4°C透析48小时，每8h换液一次，目的是使变性的Urea透析彻底；

4)透析结束后，用无菌蛋白小瓶保存蛋白。使用前用BCA测蛋白浓度，并通过非变性电泳验证蛋白制备的是否正常。

蛋白浓度的测定

使用Thermo的BCA试剂盒测量mCRP浓度(Urea制备)，BCA工作液是由

BCA(Bicinchoninicacid)和Cu2+(CuS04)等试剂组成。在碱性环境下，BCA与蛋白质结合时，Cu2+被还原为Cu+，—个Cu+螯合二个BCA分子，并形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处的光吸收与蛋白质浓度成正比。

标准曲线样品(BSA)的制备(表2.1)；通过估算，将透析后的mCRP稀释至浓度在5-20(Vg/mL范围内；准备BCA工作液：50体积的A液与1体积的B液(A：B=50：1)震荡混匀，配置好的工作液避光室温一般可以保存几天，且配置工作液时一般会多出一份，以防最后一个偏少；

我们使用的是微孔板测量蛋白浓度，这就要求样本与工作液之比为：1：8。

分别取标准品和要测样本(mCRP)各25ul加入到96孔板，然后每个孔加入200ul工作液，水平摇动30s，然后置于恒温箱37°C保温30min；96孔板取出冷却至室温(约3111丨11)，用酶标仪5621101测定吸光度值；然后将标准品和样品的光密度值减去空白对照(稀释液)的光密度值，以标准品与光密度值拟合标准曲线，从而得出未知样品浓度。

蛋白电泳(1/20SDS和全变性)及染色

聚丙烯酰胺凝胶电泳它是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺在催化剂(如，过硫酸铵(APS))的作用下聚合而成。凝胶在作为蛋白支持体的同时，还具有分子筛的功能。

当凝胶中加入SDS即构成SDS-PAGE对于全变性SDS-PAGE来说，样品上样前在SDS(能够破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用)和某种还原剂(能够打开二硫键)在加热的条件下，蛋白被完全解聚。

变性的肽链与过量的SDS相结合带来两个后果：其一，肽链上覆盖相同密度的负电荷，并超过蛋白本身所带的电荷，结果导致所有的蛋白肽链都带上负电荷，这便是电泳过程中蛋白移向正极的原因；其二，SDS与肽链的结合，改变了肽链的构象，使得样品中所有的肽链都表现为长椭圆棒。

所以SDS与肽链的结合在电泳过程中所表现出的电泳迁移率只与分子量有关。

一般来说，SDS-PAGE采用的是不连续缓冲系统，电泳缓冲液pH值和离子强度与配胶缓冲液不同。

SDS-PAGE上层为积层胶，样品在通过多孔的积层胶时被压缩成一条很细的区带，这相当于样品中的所有蛋白处于同一“起跑线”。

SDS与肽链复合物通过起跑线后，在分离胶分子筛的作用下进行分离。SDS凝胶的有效分离范围如下(表2.2)：因为mCRP的分子量约为23kDa，所以我们分离胶选择的是12%的聚丙烯酰胺凝胶。

具体配方及操作如下：1)试剂：a.30%丙烯酰胺混合液(29.2%(m/V)丙烯酰胺+0.8%(m/V)双甲叉丙烯酰胺)；b.1.5MTris-HClpH8.8(注：调节最终pH时要保证室温)；c.1.0MTris-HClpH6.8(注：调节最终pH时要保证室温)；d.10%SDS(注：室温保存)；e.10%APS(注：4°C保存期为一周)；f.商品化TEMED(注：避光保存)；g.电泳缓冲液：7.205gGly+1.515gTris+0.5gSDS，用500mL去离子水充分溶解(500mL足够两块凝胶)。

h.5XLoadingbuffer(表2.3)：i.凝胶的制备(表2.4)；j.样品的处理及电泳：将样品与5XLoadingbuffer按4：1稀释，煮沸5-10mim冷却至室温，使用微量进样器上样；电泳设置：80V恒压待染料(溴酚蓝)前沿进入分离胶后(约42min)，将电压调到150V，当染料前沿移到凝胶底部时，关闭电源。取出凝胶模板。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶的染色

蛋白质银染的原理，即凝胶上的蛋白质所带的各种基团(如巯基、羰基等)与银结合，然后银离子被还原剂(Na2S203)还原为自由的银，可使蛋白质条带呈现深棕至黑色。银染的灵敏度高，可以达到l-l0ng蛋白/每条带。

具体操作流程：(以下试剂均按照一块胶用量配置)

凝胶的固定：将电泳完毕的凝胶小心从凝胶板上取下，置于90mm玻璃培养皿中，加入50mL固定液过夜(至少lh以上)。固定液的配置：25mL无水乙醇+19mL水+6mL冰乙酸+125叫甲醛；

凝胶的清洗：将固定后的凝胶先用50%乙醇洗涤lOmim然后用去离子水清洗2次X5min/次；

凝胶的敏化：将2)清洗后的凝胶敏化lmin。敏化液的配置：每50mL去离子水加入0.0157gNa2S203*51^0；

再次清洗：去离子水清洗3次Xlmin/次；

凝胶的银染：将4)清洗后的凝胶银染20min。银染液的配置：+47.5mL去离子H20+2.5mL10%AgNO3+37.5pL甲醛；

再次清洗：去离子水清洗4次Xlmin/次；

)凝胶的显色：将6)清洗后的凝胶显色，时间的控制以蛋白条带为准。显色液的配置：3.0g无水Na2CO3+50mL去离子H20+25|aL甲醛；

显色的终止：当凝胶上的蛋白条带清晰可见时，迅速将显色液弃掉，加入终止液。终止液的配置：25mL乙醇+19ml去离子H2O+6.0mL乙酸。

蛋白WB(Westernblotting)

Westernblotting(蛋白质印迹)，又称为免疫印迹(immunoblotting)。它是在Southern印迹的基础上，用于特异性抗体鉴别抗原的方法。

WB共分为三个阶段：第一阶段即SDS-PAGE；第二阶段为转膜阶段，就是将凝胶上的蛋白条带在电场的作用下转移到固相支持物上(如，NC膜，PVDF膜)；第三阶段为检测阶段，就是将印有蛋白质条带的膜依次与特异性抗体(一抗)和酶标记的抗体(二抗)孵育，最后显色的过程。

具体操作步骤：

转膜前：将电泳完毕的凝胶板取出，轻柔地将其撬开(可以使用镊子)。然后根据蛋白mark，分辨出自己目的条带位置，附上已经剪好的滤纸，切下与滤纸等大小的胶条；

转膜：将切下的胶条置于转膜缓冲液中平衡lOmin左右，然后依次按照三明治结构排列：(正极海绵)+三层滤纸+膜(如果是PVDF膜，需要在甲醇中活化)+切好的胶条+三层滤纸+(负极海绵)，将铺好的转膜夹子放进转膜槽，接通电源，调节电压至80V(恒压)，湿转2h。

转膜液配置：192mMGlycine，25mMTris，pH8.3?8.5，20%(v/v)methano提前预冷；3)转I吴后：a.取下膜条(NC或PVDF)，使用5%的脱脂奶粉(使用TBST配置)封闭，室温摇动2h。

TBST配置：20mMTris，150mMNaCl，pH7.4，0.05%(v/v)Tween-20；b.将封闭后的膜条取出放置在90mm玻璃培养皿中使用TBST清洗3次X5min/次，然后加入一抗(抗体稀释液稀释)于4°C摆动孵育过夜。

抗体稀释液：l%(w/v)BSA，TBST配置；c.取出一抗(回收)孵育的膜条，TBST清洗3次X5min/次，加入二抗(抗体稀释液稀释)，室温摆动孵育lh，取出膜条TBST清洗3次X5min/次；d.膜条显色，在暗室中取ECLA液和ECLB液(1：1)混合，涂抹到孵育过二抗的膜条上，肉眼观察发光情况(一般10—30s)。盖上保鲜膜并将X光胶片平铺于膜条上方，关闭曝光盒中。

曝光后，经过显影、定影后，用清水冲洗千净胶片置于室温晾干，后扫片分析。

无脂蛋白血清(LPDS)的制备

血清脂蛋白是由血液中脂质与某些特异蛋白组成的一类不均一的复合物，根据其密度(密度范围：0.96g/ml或更低至1.21g/ml之间)分为：乳密颗粒，极低密度脂蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白。

对于血清中脂蛋白的剔除有多种方法，采用密度梯度超速离心剔除各种脂蛋白仍是简便、实用和剔除效率高的好方法。

具体操作步骤：

取胎牛血清，定量移入烧杯中，根据pinitial=m/v，用万分之一分析天平根据称量法测出血清初始密度pinitiai；KBr(g)=Vo(pfinal-pinitial)/(l-0_312xpfma，Vo代表原血清毫升数，pinitiai代表初始血清密度，pfinai代表需要调定的血清密度，0.312为KBr的比容(mLig-l)，KBr代表需加KBr的克数；用干燥KBr调血浆密度至1.25g/ml，充分溶解，保存于4°C冰箱中；待固体溴化钾完全溶解后，用注射器沿管壁小心铺加血清12ml。

放入超速离心机内，设置各项参数：温度10°C，P90AT号转子，60，000rpm(225，000g)X48hs；离心结束后取出离心管，将上层血清脂蛋白小心吸取弃掉，取出最低层无脂血清；将5得到的血清用去离子水稀释，后加入KBr将血浆密度调至1.25g/ml，再次离心24hs。收集6的无脂血清，使用PBS-Ca透析。

参考文献：Pepys，M.B.，CRPornotCRP?Thatisthequestion.ArteriosclerThrombVascBiol，2005.25(6):p.1091-4.Lowe，G.D.andM.B.Pepys，C-reactiveproteinandcardiovasculardisease:weighingtheevidence.CurrAtherosclerRep，2006.8(5):p.421-8.Moncada，S.andEA.Higgs，Nitricoxideandthevascularendothelium.HandbExpPharmacol.2006(176Pt1):p.213-54.Conway，EM，etal.，TumornecrosisfactorenhancesexpressionoftissuefactormRNAinendothelialcells.ThrombRes1989.53(3):p.231-41.

好了，本文到此结束，如果可以帮助到大家，还望关注本站哦！